湖南中医药大学
王若光 教授，博士生导师（医学博士，生物学博士后）
摘要：目的：研究黄芪丹参复方成分提高胎盘血供的分子机制，为临床有效防治胎盘血供不足所致妊娠并发症提供思路。方法：提取分离有效中药黄芪、丹参复方成分，运用NOS（一氧化氮合酶）阻滞剂L-精氨酸甲酯（L-NAME）制作一氧化氮合成阻滞大鼠模型，妊娠18日取胎盘组织，核酸原位杂交技术检测胎盘滋养细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达。结果：模型组MMP-9 mRNA表达明显增加，明显高于空白组和中药黄芪丹参治疗组，中药黄芪丹参治疗组与空白组比较差异无显著意义（P>0.05）。结论：黄芪丹参复方成分可能通过抑制胎盘滋养细胞MMP-9 mRNA表达，阻抑蜕膜崩解、防止胎盘后出血，而有利于胎盘滋养细胞侵入及妊娠维持。
主题词：妊娠，高血压，合并症 一氧化氮 胎盘 滋养细胞 基质金属蛋白酶类 黄芪 丹参
妊娠高血压综合征（简称妊高征，PIH，下同）和胎儿宫内生长迟缓（即胎萎不长，IUGR，下同）是导致孕产妇和婴儿病率及死亡率升高的主要原因，严重影响人口质量。确切病因均尚未明确。我们在前期研究基础上[1~4]，通过进一步观察胎盘滋养细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达变化，探讨中药复方有效成分对一氧化氮合成阻滞大鼠模型胎盘滋养细胞侵入，子宫蜕膜基质崩解、结构重塑等环节的影响机制。
1、材料与方法
中国科学院上海实验动物中心提供清洁级SD系大鼠110只（实验动物合格证：中科动管003号）；雌雄2:1分笼饲养，鼠龄100-120天，体重200-250g。雌鼠按妊娠顺序随机分为模型组、空白组、对照组、治疗组，每组15只进行实验。以益气化瘀立法黄芪丹参复方组分（黄芪提取黄芪皂甙、黄酮类；丹参提取丹参酮、丹参醌、丹参酸），由湖南中医学院药学院制成注射液，每毫升生药含量为2g，灭菌冷藏备用。L-精氨酸甲酯（L-NAME，L-Ornithine, USA Cayman Chemical公司产品）。动物造模：于妊娠第10天起皮下注射L-NAME，每天125mg/kg体重，空白组10只，于妊娠第10天开始皮下注射双蒸水，量同模型组，分别至妊娠第18天；治疗组、对照组造模方法同模型组，并且治疗组同期腹腔注射黄芪丹参复方组分（1050mg/kg）体重。对照组同期腹腔注射硝酸甘油1350μg/kg体重。每组于第8天及第18天测血压，24小时尿液测定24小时尿蛋白；妊娠12、18天时，在25%乌拉坦麻醉下，剖腹取胎，观察子宫胎盘形态，记录胎仔体重等各项指标。原位杂交检测试剂盒Boster公司产品(产品编号：MK1540；保存：4℃；工作量：100张切片；有效期：1年。适用种属：人和大鼠、小鼠等动物。大鼠、小鼠和人的靶基因序列相同)。
原位杂交染色步骤：采用MMP9的寡核苷酸探针，经地高辛标记。多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，配合敏感性加强型的原位检测方法，灵敏清晰，结果准确可靠。新鲜标本修整0.2~0.5cm2放入4%多聚甲醛中固定10分钟，取出30%蔗糖液脱水至沉，取出OCT（甲基纤维素）包裹，异戊烷-液氮法速冻。YO-202型冰冻切片机及一次性切片刀（浙江金华益迪医疗设备厂）分别5μ、20μ切片；载玻片清洗、硅化、多聚赖氨酸包被；切片纯丙酮固定15分钟，0.5% H2O2/甲醇溶液浸泡30分钟，灭活内源性过氧化物酶。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化30~120s,暴露mRNA片段。0.5M PBS洗3次×5分。蒸馏水洗1次。预杂交，干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱37~40℃2~4小时。吸取多余液体，不洗。杂交：按每张片20μl杂交液，加在切片上。将ISH专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱40~42℃杂交过夜。杂交后洗涤，揭掉盖玻片，30~37℃左右水温的2×SSC洗涤5分×2次；0.5×SSC洗涤15分×1次；0.2×SSC洗涤15分×1次。滴加封闭液，37℃30分。甩去多余液体，不洗。滴加生物素化地高辛，37℃60分或20℃左右120分。0.5M PBS洗5分×4次。滴加SABC，37℃20分或20℃左右30分。0.5M PBS洗5分×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。滴加生物素化过氧化物酶，37℃20分。0.5M PBS洗5分×4次。DAB显色20-30分。蒸馏水充分洗涤。酒精脱水，二甲苯透明，封片。结果观察 iNOS mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。统计方法：数据输入SPSS10.0方差分析统计。
MMP-9寡核苷酸探针序列：
⑴5’— GCTAT CCAGC TCACC GGTCT CGGGC AGGGA—3’
⑵5’— GGGAA GACGC ACAGC TCTCC CGCCG AGTTG—3’
⑶5’— TAGGT CACGT AGCCC ACTTG GTCCA CCTGG—3’
2、结果与分析
原位杂交的阳性等级按以下方法计算：①阳性细胞数：阳性细胞≤10%、≤30%、≤70% 和＞70%分别计1、2、3和4分；②阳性着色强度：杂交信号强度可分为弱、中、强三级分别计1、2和3分，上述两种计分相加, 1-3分者为阴性, 4-5分者为阳性, 6-7分者为强阳性。每组选5个不同个体标本，每个标本随机取10张切片，每个切片400倍光镜下观察3个视野，共计30个视野，积分累计进行统计分析。
MMP-9 mRNAISH染色比较（X±s）
分组 n 滋养细胞MMP-9 mRNA表达强度
空白组 30 3.266667±1.910648
模型组 30 17.86667±4666338*
对照组 30 10.56667±2.699723*
治疗组 30 3.5±1.75676*
*治疗组、空白组、对照组与模型组比较，均差异<0.01。
MMP-9属基质金属蛋白酶类，多来自于粒细胞和单核细胞，胎盘滋养细胞存在MMP-9 mRNA的表达，其表达上升与胎盘后出血、蜕膜基质崩解有关。上述结果表明：一氧化氮合成阻滞后，导致胎盘滋养细胞缺血、缺氧，刺激MMP-9 mRNA表达上升，可能诱发出血、滋养细胞坏死，可能引起胎盘早剥。胎盘早剥是妊娠高血压综合征的常见并发症。黄芪丹参复方成分治疗组MMP-9 mRNA表达明显低于模型组，说明中药对胎盘部分MMP-9 mRNA异常表达有抑制作用，这可能是中药有利维持妊娠继续的机制之一。
空白组滋养细胞MMP9 mRNA表达
模型组滋养细胞MMP9 mRNA表达
对照组滋养细胞MMP9 mRNA表达
治疗组滋养细胞MMP9 mRNA表达
3、讨论
在胚卵种植和胎盘形成过程中，滋养细胞侵入子宫内膜，滋养细胞的这种侵入与恶性肿瘤细胞的转移扩散相似，不同的是，正常情况下，滋养细胞的这种侵入能力受到严格的调控，使得滋养细胞只能侵入蜕膜层。研究表明，MMPs和TIMPs是关键的调控因子，滋养细胞产生的MMPs通过降解子宫内膜的胞外基质促进滋养细胞的侵入，而蜕膜层产生的TIMPs则通过抑制MMPs抑制滋养细胞的侵入，在众多的MMPs和TIMPs中，MMP-9和TIMP3可能是最主要的调控因子[6-11]。子宫内膜的蜕膜化需要MMPs参与，围着床期MMPs表达下降，有利于保护血管周围的胞外基质，防止在滋养层浸润时局部血管出血，有助于胚胎植入。本研究表明，妊娠18天，NO合成阻滞的模型组MMP-9 mRNA表达明显高于空白组，中药治疗组MMP-9 mRNA明显低于模型组，与空白组相近，PIH常易并发胎盘早剥，胎盘后出血是导致胎盘早剥、早产的主要原因[6-11]。黄芪丹参复方成分可能是通过降低滋养细胞MMP-9 mRNA表达，防止胎盘后出血，有利妊娠的维持。
参考文献
[1]尤昭玲，王若光.妊娠高血压综合征中医药研究思路.中国中西医结合杂志2002,7:37
[2]刘正刚，王若光，尤昭玲，等.一氧化氮合成阻滞模型大鼠血浆一氧化氮变化及益气化瘀法干预作用.实用预防医学杂志2002,9:36
[3]刘正刚，王若光，尤昭玲，等.一氧化氮合成阻滞模型大鼠血浆肿瘤坏死因子α变化及益气化瘀法干预作用.实用预防医学杂志2002,10:47
[4]王若光，尤昭玲，李克湘，等.益气化瘀法对胎萎不长大鼠胎盘形态学影响研究.中国中医药科技1997;4(1):41
[5]石芳鑫，尚涛，殷秀凤.一氧化氮合酶与妊高征发病关系的研究进展.国外医学1998,25(6):326
[6]王凌，濮德敏.基质金属蛋白酶与女性生殖生理.国外医学计划生育分册2002,21(1):31
[7]王晗，董旭，葛常辉，等.基质金属蛋白酶在生殖中的作用与调控.国外医学计划生育分册2002,21(3):141
[8] Curry TE Jr,Osteen KG.Cyclic changes in the matrix metalloproteinase system in the ovary and uterus.Biol Reprod,2001,64(5):1285-1296
[9] Whiteside EJ,Jackson MM,Herington AC,et al.Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 are key regulatcrs of extracellular metrix degradation by mouse embryos.Biol Reprod,2001,64(5):1331-1337
[10] Lenhart JA,Ryan PL,Ohleth KM,et al.Relaxin increases secretion of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 during uterine and cervical growth and remodeling in the pig.Endocrinology,2001,142(8):3405-3413
[11] Palejwala S,Stein DE,Weiss G,et al.Relaxin positively regulates matrix metalloproteinase expression in human lower uterine segnent fibroblasts using a tyrosine kinase signaling pathway.Endocrinology,2001,142(8):3405-3413
Study on the Effection of the components of Mongolian milkvetch root –Dan-shen root Compound on the Expression of Matricial Metal Protease-9 (MMP-9) mRNA on placental Nourish cells of Nitrogen Oxide Synthesis Blocking Pregnant Rats
Wang Ruo-guang, Chen Xue-dong,Liu Xiao-li,You Zhao-ling,He Fu-yuan,Li Jie,Xie Hui
(Department of Intergrated Traditional and Western Medicine, Hunan Chinese Medicine College, Changsha, 410007)
[Abstract] Objective: To supply clinic train of thought on effectively preventing and treating pregnant complications caused by insufficient placental blood supply, bying exploring the molecular mechanism of the components of Mongolian milkvetch root –Dan-shen root compound elevating placental blood supply. Methods: Sepeate and abstract the effective components of Mongolian milkvetch root –Dan-shen root ,apply L-Arginine methyi ester (L-NAME) to pregnant rats to make Nitrigen Oxide Synthesis blocking model ,on day 18 of pregnancy paunched the rats and took out the placenta tissue and inspect the expression of placental nutrient cells MMP-9 mRNA by the method of in situ hybridization of nucleic acid. Results: The expression of MMP-9 mRNA of model group was obviously higher than those of blank group and treat group by Mongolian milkvetch root –Dan-shen root. The expression of treat group by Huangqi and Danshen was not significantly different from that of blank group (p>0.05). Conclusion: The components of Mongolian milkvetch root –Dan-shen root compound may restrain the collapse of decidua and blooding behind the placenta and then keep pregnancy going on by restraining the expression of nutrient cell MMP-9 mRNA.
Key Words: pregnancy, hypertension, complication, nitrogen oxide (NO), placenta, Nourish cell, matricial metal protease (MMP), Mongolian milkvetch root，Dan-shen root
