湖南中医药大学
王若光 教授，博士生导师（医学博士，生物学博士后）
摘要：目的 研究黄芪丹参复方成分提高胎盘血供的分子机制，为临床有效防治胎盘血供不足所致妊娠并发症提供思路。方法 提取分离中药黄芪、丹参复方成分，运用NOS（一氧化氮合酶）阻滞剂L-精氨酸甲酯（L-NAME）建立一氧化氮合成阻滞大鼠模型，ELISA法检测妊娠18日大鼠血浆IL-1、IL-10水平，以及胎盘超微形态学变化，大鼠血压、尿蛋白变化，以及仔鼠重、肝脑重、胎盘重等。结果 一氧化氮合成阻滞模型组IL-1含量较空白组明显高于空白组（P<0.01），经黄芪丹参注射液治疗后，血浆IL-1水平比模型组明显降低（P<0.05）。模型组IL-10含量较空白组低（P<0.01），经黄芪丹参注射液治疗后，血浆IL-10水平高于模型组（P<0.05）；胎盘形态学、血压、尿蛋白以及仔重，仔肝脑重等均有显著差异（P<0.05，P<0.01）。结论 黄芪丹参复方成分可能对妊娠早期母-胎界面免疫平衡具有调控作用，通过促进局部生理抑制性免疫反应增强和杀伤、排斥免疫反应减弱，从而有利于母胎循环构建，维持胎盘血液供应。
关键词 妊娠 高血压 一氧化氮 白细胞介素1,10 胎盘 丹参 黄芪
The Study on the Change of Blood Plasma Level of IL-1,IL-10 of Nitrogen Oxide Synthesis Blocking Rats and the Treatment Fuction of Components of Mongolian Milkuetch Root-Red Sage Root Compoud on Them
(hunancollege of TCM ,changsha,410007)
Abstract
Objective: To supply clinic train of thought on effectively preventing and treating pregnant complications caused by insufficient placental blood supply,bying exploring the molecular mechanism of the components of Mongolian milkuetch root –red sage root compound elevating placental blood supply. Methods: Separate and abstract the effective components of Mongolian milkuetch root –red sage root ,apply L-Arginine methyl ester (L-NAME),a kind of NOS retarder , to pregnant rats to make Nitrgen Oxide Synthesis blocking model and then inspect their blood plasma level of IL-1,IL-10and the change of their placent ultrastructure, blood pressure and urioprotein, their babies'weights ,weights of the liver , brain and placentas by the method of ELISA. Results: the blood plasma level of IL-1 of model group was obviously higher than that of blank group (P<0.01),and significantly lower than before after the treatment of injectio the components of Mongolian milkuetch root –red sage root compound (P<0.05).while the blood plasma level of IL-10 of model group was lower than blank group(P<0.01),and significantly get higher after the treatment(P<0.05).In addition the tow group were significantly diffferent in placental ultrastructure, blood presure, urioprotein, and the weight of their babies'bodies, livers and brains ,too (P<0.05,P<0.01).Conclusion: The components of Mongolian milkvetch root –red sage root compound may adjusts and controls the immunity balance between mother and embryo in the early pregnancy,by promoting the depressive immunoreaction and weakening the antipersonel and repellent immunoreaction .In this way ,it can elevate the placental blood supply and do good to setting up the placental circulation.
Key Words: pregnancy, hypertension, Nitrogen Oxide (NO), Nourish cell, IL-1,IL-10, placenta,root of Mongolian milkuetch , root of red sage,
妊娠高血压综合征是导致孕产妇和胎婴儿死亡的一个重要的原因，其病因病机目前尚未完全阐明。妊娠是一种成功的半同种移植现象，其成功有赖于母-胎免疫平衡。母-胎免疫平衡失调，导致类似移植脏器排斥的免疫反应（如子宫螺旋小动脉急性粥样硬化和纤维素样坏死等），可能是导致妊高征发病的重要原因之一[1~3]。本研究在前期研究基础上[3~6]，运用一氧化氮合成阻滞剂L-精氨酸甲酯（L-NAME）造成妊娠高血压动物模型，探讨妊高征发生的免疫耐受机制以及黄芪丹参复方成分提高胎盘血供的作用机制。现将结果报告如下：
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物 中国科学院上海实验动物中心提供清洁级SD系大鼠75只（实验动物合格证：中科动管003号）。雌雄2:1分笼饲养，鼠龄100-120天，体重200-250g。将动情期雌鼠与雄鼠按２:1合笼过夜，次晨取阴道生理盐水冲洗液镜检，发现精子者为妊娠第1天，妊娠期每天称体重1次。雌鼠按妊娠顺序随机分为模型组、空白组、对照组、治疗组，每组15只进行实验。
1．1．2 药物 以益气化瘀立法黄芪丹参复方组分（黄芪提取黄芪皂苷、黄酮类；丹参提取丹参酮、丹参醌、丹酚酸，各成分比例4:1:2:2:1，黄芪甲苷、丹酚酸进行质控），14.5%乙醇作溶媒，离心清液0.25μm微孔滤膜过滤，由湖南中医学院药学院制成注射液，每毫升相当于生药量为2g，灭菌冷藏备用，按0.3ml/100g体重给药。硝酸甘油批号20010924，北京明兴制药出品，按体重给药。
1．1．3 试剂 L-精氨酸甲酯（L-NAME，L-Ornithine, USA Cayman Chemical公司产品）。无水乙醇（分析纯，长沙金山化学试剂公司）按要求配成25%浓度备用，给药体积同中药组。IL-1、IL-10检测试剂盒（购于上海贝西B&C公司，sigma分装产品），试剂盒组成（①已包被酶标板48/96；②一抗工作液1支；③酶联物工作液1支，④样品稀释液1支；⑤TMP显色剂A1支；⑥TMP显色剂B1支；⑦标准品（1000pg/ml）1支；⑧浓缩洗涤液（50倍）1支；⑨终止液1支；封板纸及坐标纸各1张）。
1．1．4 仪器 XDS-1B双目倒置显微镜，徕卡公司；BTS-20-M数彩显策图像分析系统（英）；高速离心机（德Heraeus Biofuge）；DF-101B集热式恒温磁力搅拌器（浙江乐清乐成电器厂）；828型pH/ISE测试仪，美国奥立成（orion）公司等。550型酶标仪，美国BIO RAD生产。
1．2 方法
1．2．1 动物造模：于妊娠第10天起皮下注射L-NAME，每天125mg/kg体重，空白组10只，于妊娠第10天开始皮下注射双蒸水，量同模型组，分别至妊娠第18天。
1．2．2 给药方法 每组于妊娠第10-18天腹腔注射给药。治疗组、对照组造模方法同模型组，并且治疗组同期腹腔注射黄芪丹参复方注射液4ml/kg体重。对照组同期腹腔注射硝酸甘油1350μg/kg体重；乙醇组腹腔注射14.5%醇水，量同中药组。
1．2．3 观察指标 每组分别于妊娠第6天及第18天测量孕鼠尾动脉血压，第6天血压作为基础血压。妊娠第17天将孕鼠放入标准代谢笼，收集 24h尿液测定24h尿蛋白。妊娠18天，25%乌拉坦麻醉下，剖腹取胎及胎盘。孕鼠颈总动脉取血，离心取血清-20℃保存备用；剖腹取胎，观察子宫胎盘形态，记录胎仔等相关指标。
1．2．4 ELISA法（ABC-HRP）法检测IL-1、IL-10含量
1．2．4．1 标本取样及预处理：①洗涤液：用ddH2O或去离子水1:50稀释，稀释好的洗涤液室温可存2周；②吸取血清100μl，加入相应孔中待检测。
1．2．4．2 检测步骤：①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加样品稀释液100μl,第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl移至第二孔，如此对倍稀释至第七孔，最后，第七孔吸出100μl弃去，第八孔作空白对照。②样品孔每孔依次加待测样品100μl；③粘上封板纸，放37℃温育60分钟；④用洗涤液洗涤检测板5次，每次均在厚迭吸水纸上拍干；⑤每孔加第一抗体工作液50μl，置37℃温育60分钟；⑥洗板，同前；⑦每孔加入酶联物工作液100μl，置37℃温育60分钟；⑧重复⑥；⑨每孔加入TMP显色剂A、B各50μl，37℃避光显色5～10分钟；每孔中加终止液50μl，轻轻混合；550型酶标仪（美国BIO RAD）450nm波长读值。
1．2．4．3 结果测定：①每个标准品和样品的OD值均应以空白对照调零；②绘制标准曲线，标准品浓度作横座标，OD值作纵坐标，作标准曲线；或以直线回归方程制图。求出标本浓度。
1．3 统计学方法 所有数据均用SPSS10.0统计软件进行方差分析。
2 结果
2．1 黄芪丹参复方成分对妊高征模型孕鼠的治疗作用
模型组尿蛋白、血压水平明显高于乙醇组及空白组，经芪丹注射液治疗后，尿蛋白、血压均降低(P<0.01，P<0.05)，硝酸甘油组血压降低(P<0.05)，尿蛋白略有下降，但差异无统计学意义（见表1、2）。
表1 各组孕鼠尿蛋白、血压水平比较( ±s)
注：模型组与空白组、乙醇组比较**P<0.01，硝酸甘油组、中药组与模型组比较#P<0.05，##P<0.01, 各组处死前血压与基础血压比较□P<0.05
各组胎仔重、肝重、脑重量经方差分析，结果表明：模型组重量明显低于空白组及乙醇组(P<0.01、P<0.05)，中药组和硝酸甘油组均可不同程度地改善胎仔重、肝重(P<0.01、P<0.05)，且中药组优于硝酸甘油组（见表2）。
表2 各组动物胎仔发育情况比较(单位:g, ±s)
注：模型组与空白组比较**P<0.01；酒精组、阳性组、治疗组与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
2．2 黄芪丹参复方成分对血浆IL-1，IL-10水平的影响作用
ELISA法检测各实验组血浆IL-1、IL-10水平，结果显示：模型组IL-1含量较空白组明显升高（P<0.01），经芪丹注射液治疗后，血浆IL-1水平降低（P<0.05）。模型组IL-10含量较空白组明显降低（P<0.01），经芪丹注射液治疗后，血浆IL-10水平升高（P<0.05），见表3。
表3 各组孕鼠血浆ELISA法IL-1,IL-10含量的比较( ±s)
注：模型组与空白组比较**P<0.01，中药组，硝酸甘油组与模型组比较#P<0.05。
2．3 黄芪丹参复方成分对子宫胎盘超微结构的影响
芪丹注射液具有增加绒毛面积,防止绒毛萎缩，修复血管，减轻炎性反应，修复子宫-胎盘超微结构的作用，从而达到改善胎盘缺血缺氧的目的（见表4）。
表4 胎盘绒毛超微结构比较表
注：模型组与空白组、酒精组比较*P<0.05，治疗组、阳性组与模型组比较#P<0.05，##P<0.01
3 讨论
正常妊娠时子宫螺旋小动脉经历妊娠生理性改变，管壁变薄，管腔变大，PIH时这种变化仅限于蜕膜层的部分血管分支，而子宫肌层与蜕膜其他部分血管则发生急性动脉粥样化，表现为内膜细胞脂肪变及血管壁坏死，血管管腔狭窄。有研究表明，重度PIH胎盘绒毛合体结节及细胞滋养细胞有增多趋势，滋养细胞基膜增厚的绒毛及纤维蛋白样坏死绒毛亦增多，可直接阻碍母胎间气血交换[1,6,10,11]。本研究子宫胎盘复合体的形态学观察表明，NO合成障碍在胎盘血管重铸障碍所致胎盘浅表着床而引起胎盘滋养细胞缺血缺氧，以及血管内皮细胞损伤过程中扮演重要角色[4~6]。芪丹注射液治疗后，子宫胎盘部位充血、炎性反应（炎性细胞浸润）、纤维素样坏死等均明显减轻，表明黄芪丹参复方成分具有防止血管内皮细胞损伤，促进子宫胎盘床血管化生，改善胎盘床血管血供，从而达到治疗PIH的目的，其可能机制是通过促进NO的分泌、抑制TNF-α的合成，从而保证血管内皮细胞的完整而实现的。
妊娠母-胎免疫平衡主要表现为局部生理抑制性免疫反应增强和杀伤、排斥免疫反应减弱。目前研究表明，正常母-胎免疫平衡关键在于TH1/TH2之间的免疫平衡，即TH1所介导的体液免疫反应和TH2所介导的细胞免疫反应间的平衡[7~9]。IL-1、TNF-α等均为Th1型细胞因子，IL-4、IL-10，转化生长因子β1（TGFβ1）等为Th2型细胞因子。IL-10来自单核细胞、T细胞或母胎介面的其他炎症细胞；体外实验表明妊娠各阶段的细胞滋养层细胞均可产生有生物学活性的IL-10，在活检的胎盘组织中也查到IL-10 mRNA。IL-10通过下调单核细胞MHC II类抗原表达等途径，选择性抑制IL-2、3，TNF等细胞因子的合成，通过诱导IL-1受体拮抗剂的表达抑制IL-1的作用。正常妊娠过程以IL-10为主的TH2防护反应占主导，通过调节TH1/TH2平衡影响局部的免疫环境，保护胎儿和胎盘免遭排斥，但过强的TH2细胞因子反应也可导致先兆子痫。IL-1升高是母体免疫排斥反应强化的表现之一，不利胚胎着床和滋养细胞的侵入和妊娠的维持。TH1/TH2比率失衡可能是导致妊高征发生的重要因素之一[2]。黄芪丹参复方成分可能通过对TNF-α、IL-1等Th1型细胞因子以及IL-10等Th2型细胞因子表达平衡的调节作用，抑制TNF和INF-γ对血管内皮细胞的损伤作用，有利于血管内皮细胞NO合成与释放，从而提高胎盘血液供应，并减轻胎盘组织的免疫病理损伤，阻抑母胎介面的免疫排斥反应的目的，从而有利胎盘胎儿血液供应及妊娠维持。其具体机制有待于进一步的研究与探讨。
参考文献
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